PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的檢測(cè)并記錄其熒光信號(hào),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺(tái)期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時(shí)即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺(tái)期”。在該時(shí)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點(diǎn): 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價(jià)格便宜; 熒光染料的缺點(diǎn): 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會(huì)影響檢測(cè)的敏感性 非特異性產(chǎn)物會(huì)影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識(shí)別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。 產(chǎn)品名稱 | 貓衣原體探針法熒光PCR檢測(cè)試劑盒 | 英文名稱 | Chlamydia felis | 貨號(hào) | YSP96536 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成一個(gè)能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí),引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí),Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測(cè)到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測(cè),縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn): 成本高; 設(shè)計(jì)難度大; 只能用于檢測(cè)產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 釹標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000µg/mL,基體:10%HCl)FastScan™ Total Zap-70 ELISA Kit2-氯-吡啶 標(biāo)準(zhǔn)溶液(100µg/mL,基體:1%HCl)Wnt5a Antibody5-溴-6-氯煙酸甲酯 標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,,溶劑:水)PDE5 Antibody5-溴-2-氯煙酸甲酯 鐠標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000µg/mL,基體:10%HCl)MBP Tag (8G1) Mouse mAb4,4'-二乙酰聯(lián) 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(100mg/L,溶劑:水)PhosphoPlus® ULK1 (Ser757) Antibody Duet氨基-基吡啶 鍶標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml)Vav3 Antibody2,二氯 鈦標(biāo)準(zhǔn)溶液(100µg/ml)Rap1A/Rap1B (26B4) Rabbit mAb1-(2-氟-5-基)乙-1-酮 鎢標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,基體:0.1mol/LNaOH)Synip (C51G6) Rabbit mAb5-羥基-1,二 鉭標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml)Phospho-HSP27 (Ser82) Antibody2-溴噻吩-5-甲 碲標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml)Phospho-HSP27 (Ser82) AntibodyN-甲基-2-甲氧基芐 鋱標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000µg/mL,基體:10%HCl)HSP27 (G31) Mouse mAb2-氟-6-溴 釩標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,溶劑:0.5mol/L HNO3)HSP27 (G31) Mouse mAb6-溴吲唑 釔標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml in 10% HCl)BCAR3 Antibody異基酸 鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000μg/ml,基體:1mol/L HNO3)Phospho-HSP27 (Ser15) AntibodyN-CBZ-哌啶乙酸乙酯 鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液(100µg/ml,,基體:1%HNO3)Phospho-HSP27 (Ser15) Antibody氨基基酸 氯化鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1000mol/L)Phospho-HSP27 (Ser78) Antibody2-氨基-氟 鄰二甲(for HPLC,≥96.0% (GC))Phospho-HSP27 (Ser78) Antibody5-溴-2-甲氧基甲 蚜滅標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.100mg/ml)Phospho-HSP27 (Ser82) Antibody II7-羥基-1H-吲唑 貓衣原體探針法熒光PCR檢測(cè)試劑盒L-腎上腺素ELISA試劑盒HCMV UL23 巨細(xì)胞病毒UL23抗體100 ul L-酸脫氫酶(L-LDH)ELISA試劑盒HCMV UL49 巨細(xì)胞病毒UL49蛋白抗體100 ul L-氨基酸氧化酶(LAO)ELISA試劑盒MCP-1/CCL2 單核細(xì)胞趨化蛋白1抗體(大、)100 ul Klotho ELISA試劑盒MCP-1/CCL2 單核細(xì)胞趨化蛋白1抗體()100 ul KI-67抗原(Ki-67)ELISA試劑盒MCP-2/CCL8 單核細(xì)胞趨化蛋白2抗體()100 ul Jo1抗體/抗組氨酰tRNA合成酶抗體(Jo1/HRS)ELISA試劑盒MCP-2/CCL8 單核細(xì)胞趨化蛋白2抗體(大、)20 ul IV形膠原蛋白α3鏈(COL4A3)ELISA試劑盒MCP-3/CCL7 單核細(xì)胞趨化蛋白3抗體100 ul Igγ3鏈C區(qū)(IGHG3)ELISA試劑盒MCP-3/CCL7 單核細(xì)胞趨化蛋白3抗體100 ul ICOS配體(ICOSLG)ELISA試劑盒CCL9/CCL10 巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1γ抗體100 ul |