客戶只需提供樣品和待檢測基因名稱即可。由我們提取RNA，設(shè)計并合成引物，完成熒光定量PCR實驗以及后續(xù)數(shù)據(jù)分析，提供實驗報告給您。 產(chǎn)品名稱 | 粗球孢子菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Coccidioides immitis | 貨號 | YSP96571 |
熒光定量PCR試劑盒技術(shù)：
產(chǎn)品僅用于科研本實用新型技術(shù)公開了一種實時熒光定量PCR試劑盒，包括盒體，盒體由上盒體和下盒體組成，上盒體的底面上設(shè)有限位凸起，下盒體的頂面上設(shè)有與限位凸起匹配的凹槽，且在下盒體左右側(cè)壁的下端均軟連接有側(cè)蓋，側(cè)蓋遠(yuǎn)離下盒體的一端連接有卡勾，下盒體的上端邊緣處設(shè)有環(huán)形凸起，兩個卡勾分別勾住環(huán)形凸起的左右兩端將上盒體固定在下盒體上；凹槽的內(nèi)部設(shè)有固定桿，固定桿上通過轉(zhuǎn)動件轉(zhuǎn)動連接有用于放置試管的試管架；下盒體的左右兩側(cè)均設(shè)置有收納槽。本實用新型技術(shù)通過將盒體分為上下組合的兩個部分，并將兩個部分通過側(cè)蓋連接，即可保證試劑盒的便攜性，同時使用試劑盒自帶的試管可提高檢測的效率。
樣品RNA的抽提：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA質(zhì)量檢測
1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 g RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 g/ml。
正(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb丁香 滅菌唑(分析標(biāo)準(zhǔn)品,99.2%)Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb四氯三氧化二 殺蟲環(huán)標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=5%,基體：甲)Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4) Rabbit mAb3,5-二氟肼鹽酸鹽 標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=6%)Phospho-DUSP1/MKP1 (Ser359) (125E2) Rabbit mAb2-甲基-6-甲酸 氨靈(標(biāo)準(zhǔn)品)eIF4GI Antibody2-甲基-硝基吡啶 1,2,4,5-四氯標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb2,5-二氯酸 1,2,3,5-四氯(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb氟間二 氟脲(分析標(biāo)準(zhǔn)品,98%(HPLC))Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb銅鐵試劑 氟脲(分析標(biāo)準(zhǔn)品,99%(HPLC))p190-A RhoGAP (C59F7) Rabbit mAb2-氨基-溴吡啶 1,2,三氯(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>99.8%（GC))Phospho-c-Abl (Tyr245) Antibody氟-甲 1,2,4,5-四氯標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.104mg/ml,基體:異辛烷)c-Abl Antibody2,二氯-5-嘧啶 標(biāo)準(zhǔn)溶液(202mg/L,基體:甲)c-Abl Antibody2-氨基-溴甲酸甲酯 標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=4%)Plectin-1 Antibody環(huán)氧柏木烷 標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=7%)Phospho-c-Abl (Thr735) Antibody1-Boc-吡咯-2-酸 三唑(分析標(biāo)準(zhǔn)品,>97%(HPLC))Phospho-c-Abl (Tyr412) (247C7) Rabbit mAbbeta-托品 蟲酰肼(分析標(biāo)準(zhǔn)品,99%)Survivin (71G4B7) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)基-2,6-二氯-(三氟甲基)吡啶 甲基立枯(分析標(biāo)準(zhǔn)品,98%)Hexokinase II (C64G5) Rabbit mAb基-三氟甲基吡啶 殺蟲單(標(biāo)準(zhǔn)品)Hexokinase II (C64G5) Rabbit mAb1,1-雙(甲硫基)-2-亞硝基乙
粗球孢子菌探針法熒光PCR檢測試劑盒牛血栓素B2(TXB2)ELISA試劑盒RANK 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB受體抗體100 ul 牛血清淀粉樣蛋白A(SAA)ELISA試劑盒OPGL/ODF 骨保護蛋白配體抗體(破骨細(xì)胞分化因子)100 ul 牛血清白蛋白(BSA)抗體(IgG)ELISA試劑盒OPN 骨橋蛋白抗體(分泌型蛋白1)100 ul 牛血清白蛋白(BSA)抗體(IgA)ELISA試劑盒OPN 骨橋蛋白抗體(分泌型蛋白1)300 ul 牛血清白蛋白(BSA)ELISA試劑盒Orexin-A 增食欲素-A/欲激素A100 ul 牛血清白蛋白(ALB)ELISA試劑盒Osrix 成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體100 ul 牛血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR-3)ELISA試劑盒Os05g0477200 proin 水稻白葉枯病菌Os05g0477200蛋白抗體100 ul 牛血管內(nèi)皮生長因子C(VEGFC)ELISA試劑盒oxytocin receptor 催產(chǎn)素受體(縮宮素受體)抗體20 ul 牛雄二酮(ASD)ELISA試劑盒OVA 雞卵白蛋白/卵清蛋白抗體100 ul
實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM） 2μl
引物2（10PM） 2μ
Taq酶（2U/μl） 1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。好設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．產(chǎn)品僅用于科研所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。 |
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