PCR技術(shù)的定量原理: 擴(kuò)增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴(kuò)增過程進(jìn)行了實(shí)時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴(kuò)增曲線。熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴(kuò)增早期,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進(jìn)入“平臺期”。在該時期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點(diǎn): 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點(diǎn): 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴(kuò)增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進(jìn)行識別,進(jìn)而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實(shí)驗(yàn)手段。 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)氣腸桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Enterobacter aerogenes | 貨號 | YSP96656 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。 正常情況下兩個基團(tuán)的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實(shí)驗(yàn)時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點(diǎn): 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強(qiáng)度信號,這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。 一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 羅漢松樹脂酚-4'-O-β-龍膽二糖苷(標(biāo)準(zhǔn)品)BCL6 (D4I2V) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)溴基肼 石蕊Microcephalin-1/BRIT1 (D38G5) Rabbit mAb對二甲 7-O-甲基蘆薈新甙A(標(biāo)準(zhǔn)品)Microcephalin-1/BRIT1 (D38G5) Rabbit mAb溴乙 肉蓯蓉苷A(標(biāo)準(zhǔn)品)Beclin-1 (2A4) Mouse mAb羥酸 蘆薈新甙D(標(biāo)準(zhǔn)品)TIF1β Antibody(S)-哌啶甲酸 苦玄參苷IV(標(biāo)準(zhǔn)品)TIF1β Antibody羥基-2-丁酮 瓜子金皂苷XXXI(對照品)TIF1β (C42G12) Rabbit mAb2-丁炔酸 俾斯麥棕RTIF1β (C42G12) Rabbit mAb2-溴-氟甲 俾斯麥棕YSLK Antibody基鋰 偶氮氯膦ITLK1 Antibody氨基嘧啶 (標(biāo)準(zhǔn)品)Siglec-10 (D4E3Z) Rabbit mAb (Mouse Specific)5-氨基嘧啶 茜素Phospho-HSL (Ser660) Antibody戊酸 姜黃素Phospho-TIF1β (Ser824) Antibody乙酸酯 姜黃素(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-TIF1β (Ser824) AntibodyD-吡喃葡萄糖 姜黃素(高純)Ape1 Antibody1,環(huán)已二酮 熒光素Cyclin E1 (HE12) Mouse mAb葉酸 鈣黃綠素Cyclin E1 (HE12) Mouse mAb2-羥基喹啉 瑞氏色素Phospho-Cyclin B1 (Ser147) Antibody(S)-2-甲基吡咯烷 產(chǎn)氣腸桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒Coronin-1A(Coro1a/Coro1)ELISA試劑盒TSLP 胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素-1抗體100 ul c-jun ELISA試劑盒CRLF2 胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素受體抗體100µl c-fos ELISA試劑盒TSP-1/THBS1 凝血酶敏感蛋白1抗體100 ul CDP-甘油二酯--甘油-3-酸3脂酰轉(zhuǎn)移酶,線粒體(PGS1)ELISA試劑盒TTF-1 甲狀腺核轉(zhuǎn)錄因子-1抗體100 ul CDCP1 ELISA試劑盒TTF-2 甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-2抗體100 ul CD8分子(CD8)ELISA試劑盒Tubulin-alpha 微管蛋白抗體100 ul CD68分子(CD68)ELISA試劑盒Tubulin- Beta 微管蛋白抗體(免疫組化用抗體)20 ul CD63分子(CD63)ELISA試劑盒Tubulin- Beta/Tuj-1 微管蛋白抗體(免疫組化用抗體)200 ul CD4分子(CD4)ELISA試劑盒g(shù)amma tubulin 微管蛋白-gamma抗體20 ul |