PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 潰瘍棒桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Corynebacterium ulcerans | 貨號 | YSP96590 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 異(>99.5%(GC)Acidic FGF (11H11) Rabbit mAb1-溴-氯-2-氟 甲(>99.8%(GC)DYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAb (Binds to same epitope as Sigma's Anti-FLAG® M2 Antibody) (Alexa Fluor® 700 Conjuga)2-氯-氟酚 甲基環(huán)己烷(>99.0%(GC)Phospho-Ezrin (Thr567)/Radixin (Thr564)/Moesin (Thr558) Antibody1-溴-甲基-2-丁酮 正辛烷(>98.5%(GC)Phospho-Ezrin (Thr567)/Radixin (Thr564)/Moesin (Thr558) AntibodyH-ARG(PBF)-OH 草酸二乙酯(>99.0%(GC)Ezrin/Radixin/Moesin Antibody2-溴-1-((三氟甲基)基)乙酮 1,2,3,四氫萘(>98.0%(GC)Ezrin/Radixin/Moesin Antibody重鉻酸吡啶 2,2,*基戊烷(>99.0%(GC)FoxA2/HNF3β Antibody2-溴喹啉 對茴香乙溶液(含乙酸和硫酸)Phospho-Ezrin (Tyr353) Antibody1-(2-氯乙基)哌啶鹽酸鹽 2,二肼乙溶液(含鹽酸) Ezrin Antibody6-氯-1-己 溴甲酚綠乙溶液(含氫氧化鈉)Moesin Antibody1,2,三氯-5- 酮-d6 99.9原子%DPelli (D2Z4F) Rabbit mAb2-氨基-5-硝基-2'-氯二甲酮 氯-d(含有1wt%的TMS) 99.6原子%D(含穩(wěn)定劑銀屑)Ezh2 (AC22) Mouse mAb2,6-二氯氯芐 氯-d 99.6原子%D(含穩(wěn)定劑銀屑)Met (L41G3) Mouse mAb(三氟甲基)吡唑 二甲亞砜-d6 99.9原子%D(>99.0%(GC))Moesin (Q480) Antibody2-溴-1-氯-氟 甲-d4 99.8原子%DMouse (MOPC-21) mAb IgG1 Isotype Control (APC-Cy7® Conjuga)N-乙酰-L-氨酸 重水 99.8原子%DPhospho-M-CSF Receptor (Tyr723) AntibodyN-芐氧羰基-L-亮氨酸 六甲基二硅氧烷(>98.0%(GC))M-CSF Receptor Antibody()酸 六甲基二硅烷(>98.0%(GC))Progesrone Receptor A/B (C89F7) Rabbit mAb2-甲氧基-氨基吡啶 潰瘍棒桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒雞觸珠蛋白相關(guān)蛋白(HPR)ELISA試劑盒PI3K 脂酰肌醇激酶抗體100 ul 雞超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) 酸化脂酰肌醇激酶抗體100 ul 雞層連蛋白/板層素(LN)ELISA試劑盒PI3KCA/PtdIns 3 kinase p110 脂酰肌醇激酶催化亞單位A抗體20 ul 雞補體蛋白4(C4)ELISA試劑盒PI3 Kinase p110 delta 脂酰肌醇激酶催化亞單位D抗體100 ul 雞補體蛋白3(C3)ELISA試劑盒PIBF 孕激素誘導阻斷因子抗體100 ul 雞補體3裂解產(chǎn)物(C3SP)ELISA試劑盒PILR beta PILR beta抗體100 ul 雞酮酸脫氫酶E1(PDH E1)ELISA試劑盒PIM1 前病毒整合位點蛋白1抗體100 ul 雞二酸單酰輔酶A(malonyl CoA)ELISA試劑盒Phospho-PIM1(Tyr218) 酸化前病毒整合位點蛋白1抗體100 ul 雞氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)ELISA試劑盒PIRH2 泛素連接酶抗體20 ul |