熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決。總的來說,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 產(chǎn)品名稱 | 禽波氏桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Bordela avium | 貨號 | YSP96446 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團,3'端標(biāo)記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 5-溴-氯-吲哚基-N-乙酰-beta-D-氨基半糖苷IL-6 (D5W4V) XP® Rabbit mAb (Mouse Specific)5-氨基-2,二氟甲酸甲酯 巖藻黃質(zhì);褐藻素Phospho-IRAK4 (Thr345/Ser346) (D6D7) Rabbit mAb (PE Conjuga)2-溴-氟甲 乙酸鋇(>99%,BR)PathScan® Total Rb Sandwich ELISA Kit(2S,4S)-N-Boc-順式-氟-L-脯氨酸 甲酸酐(>99%,BR)PSMB5 (D1H6B) Rabbit mAb肼酸乙酯 Brij 58Syndecan 1 (D4Y7H) Rabbit mAb2-氟-(三氟甲基) 硫酸鈷七水(>99%,BR)SimpleChIP® Human Bcl-2 Promor Primers氟-氯甲 二硫代乙酰(>98%,BR)EphA2 (8B6) Mouse mAbN-甲基脲 脫氧核糖核酸酶 IISimpleChIP® Mouse MEST Promor Primers2,2-二氟 高粘度羥乙基纖維素TMEM49/VMP1 (D1Y3E) Rabbit mAb甲基丁酸甲酯 L-天冬氨酸鈉一水K6linkage Specific Polyubiquitin (D7A11) Rabbit mAb (HRP Conjuga)乙基-1-萘甲酸 鉛屑(>99%,5N)Nuclease-free War2-氯-1,萘醌 馬來酸酸酐(>98%,BC)DyLight™ 488 Phalloidin2-氨基-6-氟 鹽酸鹽(>98%,BR)Galectin-1/LGALS1 (D608T) Rabbit mAb2-氯-6-溴三氟 間二(>98%,BC)O-GlcNAc (CTD110.6) Mouse mAb (HRP Conjuga)瓜爾豆膠 粘蛋白Glut1 (D3J3A) Rabbit mAb3,5--二溴甲酸甲酯 N,N'-二琥珀酰亞基碳酸酯(>98%,EP)PCK1 (D12F5) Rabbit mAb2-硫代四氫-1,惡唑 氟化鎳四水(>98%,BR)NeuN (D3S3I) Rabbit mAb2-羥基-吡啶甲 對鹽(>98%,BC)NeuN (D3S3I) Rabbit mAb羅格列酮 禽波氏桿菌探針法熒光PCR檢測試劑盒幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1(YKL-40/CHI3L1)ELISA試劑盒FAST kinase Fas活化的絲/蘇氨酸激酶抗體100 ul 幾丁質(zhì)酶1(殼三糖酶)(CHIT1)ELISA試劑盒FasL 兔抗FasL抗體。100 ul 集蛋白亞家族成員11(COLEC11)ELISA試劑盒fatty acid elongase 脂肪酸延長酶抗體500 ul 極低密度脂蛋白(VLDL)ELISA試劑盒Fc gamma RII a/CD32a 免疫球蛋白G Fc段受體Ⅱ抗體100 ul 激肽釋放酶8(KLK 8)ELISA試劑盒FBN1 原纖維蛋白1抗體100 ul 激肽釋放酶7(KLK 7)ELISA試劑盒FDC-SP/ADC 濾泡樹突細胞分泌蛋白抗體100 ul 激肽釋放酶6(KLK 6)ELISA試劑盒Fe65 proin/APBB1 鐵蛋白Fe65抗體100 ul 激肽釋放酶2(hK 2)ELISA試劑盒FGF1/AFGF 酸性成纖維細胞生長因子抗體100 ul 激肽釋放酶11(KLK 11)ELISA試劑盒FGF3/Oncogene INT2 纖維母細胞生長因子3抗體100 ul PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 |