PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 飾紋汀蛙虹彩病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Boheliridovirus(BIV) | 貨號 | YSP96442 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 甲噻;賽拉NCK1 (5B7) Mouse mAbN-乙基-2-氨甲基吡咯烷 酵母多糖 A(>98% (HPLC),BC)TAF1 (D6J8B) Rabbit mAb1-N-Cbz-甲酰基吡咯烷 3,5-二甲酸(>98%,BR)XBP-1s (D2C1F) Rabbit mAb2,2-二乙氧基烷 40%乙溶液Phospho-Progesrone Receptor (Ser345) Antibody乙酰基吡咯烷 硫酸鈣(>99%,BR)Human Inrleukin-6 Receptor α (hIL-6Rα)三乙氧基(2-甲基基)硅烷 硝酸鈷六水(>98.0-102.0%,BR)Human Inrleukin-6 Receptor α (hIL-6Rα)三乙氧基-(2-咪唑-1-啉基)烷基硅烷 二環(huán)己基碳二亞(>99%,BR)CDK4 (D9G3E) Rabbit mAb三乙氧基硅烷 鹽酸鑭六水(>99%,BR)CDK4 (D9G3E) Rabbit mAb基三乙氧基硅烷 三氧化鉬(>98%,BR)Glutama Dehydrogenase 1/2 (D9F7P) Rabbit mAb正辛基三乙氧基硅烷 氯化鎳六水(>98%,BC)GLDC Antibody2-氯-1,1,1-三乙氧基乙烷 木瓜蛋白酶懸浮液AFAP1L2/XB130 (D4A5) Rabbit mAb(S)-(-)-2-氨基丁烷 磺酸鈉(>98%,BR)CYLD (D6O5O) Rabbit mAb(R)-(-)-2-氨基丁烷 過氧化物歧化酶(SOD)Acetyl-Histone H2B (Lys5) (D5H1S) XP® Rabbit mAb三乙烷基(三氟甲基)硅烷 四正丁基溴化銨(>98%,BC)Acetyl-Histone H2B (Lys5) (D5H1S) XP® Rabbit mAb1,二乙酰氧-2-(二乙酰氧氧基)烷 三十烷(>98%,植物激素級)STF-1 (D1Z2A) XP® Rabbit mAb甲基二乙氧基硅烷 羥基甲(>98.0%,BR)K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb (HRP Conjuga)2,4,6-三乙基-2,4,6-*基環(huán)三硅氧烷 低內(nèi)毒素牛血清白蛋白PDBu (Phorbol 122,2,2-三氟乙磺酸酯 梭菌蛋白酶PTMScan® Cleaved Caspase Substra Motif [DE(T/S/A)D] Kit(R)-(-)-2-氨基-1-芐氧基丁烷 飾紋汀蛙虹彩病毒探針法熒光PCR檢測試劑盒降脂素(Adipsin)ELISA試劑盒EXPB-2 植物延展素-β100 ul 降鈣素原(PCT)ELISA試劑盒AXPA10 植物延長蛋白(擬南芥)100 ul 降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)ELISA試劑盒Ezrin/Radixin 埃茲蛋白抗體100 ul 降鈣素(CT)ELISA試劑盒Phospho-Ezrin (Tyr353) 酸化埃茲蛋白抗體100 ul 性胎兒蛋白(BFP)ELISA試劑盒Phospho-Ezrin (Thr567) 酸化埃茲蛋白抗體5 mg 性酸酶(ALP)ELISA試劑盒F1 operon positive regulatory proin(NT) 肺鼠疫耶爾森氏菌F1莢膜蛋白抗體(N端)1 mg 性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子ATF樣蛋白(BATF)ELISA試劑盒F1 operon positive regulatory proin(CT) 肺鼠疫耶爾森氏菌F1莢膜蛋白抗體(C端)100 ul 性成纖維細胞生長因子(bFGF)ELISA試劑盒instinal FABP/IFABP 腸型脂肪酸結(jié)合蛋白抗體100 ul 間皮素(MSLN)ELISA試劑盒FABP(brain) CT 腦型脂肪酸結(jié)合蛋白抗體(C端)50 mg |