PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 犬腺體病毒2型探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Canine Adenovirus Type 2(CAV-2) | 貨號 | YSP96509 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! 十二(標準品)HSL (D6W5S) XP® Rabbit mAb二甲酰硫素 二乙(DEA)(標準品)Liprin β1 AntibodyN-甲?;?2-氯-5-三氟 2,二硝基氯標準溶液(1.00mg/ml,基體:甲)Ghost Dye™ Red 780 Viability DyeMETHOXY-2-(TRIFLUOROMETHYL)PHENYLBORONIC ACID, PINACOL ESR 標準溶液(100μg/ml,溶劑:甲)TRAF4 (D1N3A) Rabbit mAb反式-基-1-基-酸 2,二氯甲(標準品)Syntaxin 1A (D4E2W) Rabbit mAb2-[(乙酰硫)甲基]-基酸 2,5-二氯甲(標準品)Flotillin-1 (D2V7J) XP® Rabbit mAb(R)-(-)-alpha-甲氧基 3,二氯(標準品)Flotillin-1 (D2V7J) XP® Rabbit mAb2,5-二氟磺酰 3,二氯聯(lián)(標準品)Vinculin (E1E9V) XP® Rabbit mAb (HRP Conjuga)羥基-2-萘甲酸甲酯 直接藍6(標準品)ALDH2 AntibodyFLUORO-5-METHOXYBIPHENYL-CARBOXYLIC ACID 分散橙37(標準品)Smac/Diablo (D5S3R) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)6-氯-5-甲基吡啶-酸 鄰二甲酸二酯(標準品)MAVS (D5A9E) Rabbit mAb (PE Conjuga)1-溴-2-甲基萘 二甲基二氯化錫(標準品)ULK1 (D8H5) Rabbit mAb (Biotinylad)(2-溴-氧基)四氫-2H-吡喃 二乙基錫(標準品)VISTA (D1L2G™) XP® Rabbit mAb (PE Conjuga)硒脲 甲基內(nèi)吸(標準品)T2 (D6B9Y) Rabbit mAb6-(CYCLOPROPYLAMINO)-5-NITROQUINOLINE 2,4'-滴滴涕(標準品)PKM1 (D30G6) XP® Rabbit mAb (PE Conjuga)5-甲氧基黃酮 2,4′-DDT標準溶液(100μg/mL,基體:異辛烷)PSD93 (D4Z4D) Rabbit mAb(氟-甲氧基基)三氟酸 4,4'-滴滴涕(標準品)DMAP1 (D4O2G) Rabbit mAb(R)-(+)-2-氯酸甲酯 溴菊酯(標準品)SimpleChIP® Human DMD Intron 2 Primers2-吡啶乙酸甲酯 犬腺體病毒2型探針法熒光PCR檢測試劑盒白介素5受體alpha(IL5RA)ELISA試劑盒Phospho-IRAK1 (Thr387) 酸化白介素-1受體相關(guān)激酶1抗體100 ul 白介素5(IL-5)ELISA試劑盒IRF3 干擾素調(diào)節(jié)因子3100 ul 白介素4受體(IL4R/CD124)ELISA試劑盒Phospho-IRF3 (Ser396) 酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3100 ul 白介素4(IL-4)ELISA試劑盒IRAK4 白介素-1受體相關(guān)激酶4抗體100 ul 白介素37(IL-37)ELISA試劑盒IL-1RA 白介素-1受體拮抗劑抗體100 ul 白介素35(IL-35)ELISA試劑盒IL-1R1 白介素1受體1抗體100 ul 白介素33(IL-33)ELISA試劑盒IL-1R II 白介素1受體Ⅱ抗體100 ul 白介素32(IL-32)ELISA試劑盒IRF4 干擾素調(diào)節(jié)因子4抗體100 ul 白介素31(IL-31)ELISA試劑盒ILT2/CD85j 細胞表面免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄因子2抗體100 ul |